为了克服常规探针设计中的灵敏度和特异性之间的相互制约，我们提出了一种基于竞争性DNA杂交的创新方法。

基于这一理论，我们创造了4路Strand Exchange LED竞争性DNA测试（SELECT）系统，成功突破了逆相关性限制。

通过SELECT系统，在统一条件下，我们成功鉴定了人类基因组中的16个热点突变，而无需进行繁琐的优化步骤。

这一研究为DNA杂交技术的发展提供了新的思路和方法，不仅解决了传统方法中灵敏度和特异性之间的制约，还为高效、准确地鉴定基因组中的突变提供了一种有效途径。

通过这项创新性工作，我们为核酸化学研究和应用开辟了新的前景，有望在基因分析、生物医学研究等领域产生重要影响。

一、实验背景介绍

DNA杂交在基于DNA的传感器、分析方法和材料中一直扮演着核心角色，其灵敏且特异的特性尤为关键。

在微小遗传变异检测等分子诊断分析中，DNA杂交的高灵敏性和特异性至关重要，如基因分型、DNA微阵列、突变检测等。

其作为潜在癌症早期标志物的应用前景备受期待，然而ctDNA隐藏在大量野生型无细胞DNA中，要求高度区分突变型和野生型DNA，仅相差一个碱基。

已有多种核酸检测方法致力于区分单碱基错配，如复杂结构探针、酶辅助DNA探针、条形码检测、选择性PCR和下一代测序等，这些方法在某些步骤中依赖于DNA杂交的特异性。

区分单碱基错配仍然具有挑战性，尤其对于稳定错配如X:G (X = A,T,G)，与其他错配如X:C相比，判别效率较低。

竞争性DNA链常用于提高DNA探针系统的识别效率，被称为“阻塞器”或“钳位器”，阻断链与野生型DNA杂交并阻止其与探针进一步杂交。

阻断链提高了突变型DNA在单链DNA池中的比例，有助于后续探针的区分。探针和阻断剂的竞争性组合已成为核酸测定中最常用的设计策略。

研究表明竞争性组合物的敏感性和特异性在一定程度上呈负相关，阻断链长度和浓度的改变会影响灵敏性和特异性的平衡，因此需要复杂的优化过程。

我们建立了竞争性DNA杂交的理论模型，揭示了热力学和动力学对灵敏性和特异性的共同影响。

基于这些基础，让我们提出的4路链交换LED竞争性DNA测试系统（4路SELECT系统），通过霍利迪连接分支迁移实现。

理论和实验结果均表明，这一系统成功突破了灵敏性和特异性之间的内在矛盾，不仅保持了高灵敏性，还显著提高了特异性，使序列设计和反应条件得以简化和统一，无需额外优化。

二、实验材料制备

2.1线位移探针/标准阻断剂组合系统

在热力学模型的详细检查中，我们发现灵敏度单调递减的主要原因是阻断链完全负面影响了系统灵敏度，因为它无法为PMT的形成提供自由能驱动。

为了解决这一问题，我们尝试通过优化探针结构，使阻断链不仅可以捕获MT，还能在一定程度上为PMT的形成提供自由能驱动。

我们将单独的探针对目标链的灵敏度定义为F (x, [PS] 0)，其中x是平衡常数，[PS] 0是探针的初始浓度。

值得注意的是，尽管在某些情况下特异性曲线可能出现小波动，但特异性不断增加，使得系统特异性在一定范围内持续提高。

模型中的反应2动力学常数非常小，几乎不可反应，导致整个体系似乎被困在BMT+PS中，进而影响了计算结果的准确性。

在这过程中意识到虽然链置换探针/标准阻断剂组合系统在缓解热力学中的逆相关性方面具有潜力，但动力学陷阱的存在几乎使得该设计无效，使计算结果受到很大影响。

从反应路径分析中我们可以得知，为了打破动力学陷阱，关键是要为BMT+PS向PMT+BS的转化创造一条新的反应路径。

考虑到当前设计中没有引发这种转化的立足点，我们自然而然地想到了移动阻断序列的想法，从而为MT通过4路链交换逃逸出BMT状态并转化为PMT。

此外系统灵敏度的值范围为我们提供了重要的指导，通过将阻断剂序列移到适当的区域，可以实现ΔG BM （ΔG BW + ΔΔGB）与ΔG BS 相等，并且系统的灵敏度可以保持恒定。

以上的实验证明了我们的研究，揭示了热力学和动力学之间的复杂相互作用，为构建具有高灵敏性和特异性的DNA杂交系统提供了有益的洞察。

虽然动力学的缺陷导致现有设计不能完美的检测他们的变化，但我们通过思考新的反应路径和适当的序列调整，有望克服这些问题，为多突变高通量分析等领域的发展提供更大的潜力。

三、实验结果

3.1 探针制备和反应设置

为制备探针，我们将Q链和F链以1:1比例混合，加入1× ThermoPol反应缓冲液（New England Biolabs）。

然后使用PCR机进行热退火处理，初始加热至95°C，持续5分钟，然后冷却至20°C，持续75分钟。最后，将制备好的探针溶液储存在4°C，待使用。

3.2基于时间的荧光采集

我们使用Synergy HTX多模式酶标仪进行基于时间的荧光数据采集。为了减少机器间差异的影响，我们在同一台仪器上进行目标的所有实验。

荧光采集持续时间因实验而异，通常将最大持续时间设置为4小时。

如果反应似乎已趋于平衡，我们可以提前终止实验以更快地获取数据。

在实际应用中，我们主要关注未知样品和对照之间的差异。因此，即使反应未达到平衡，我们也可以在达到目标时停止检测。

3.3PCR 后基因分型和低丰度突变检测

分析物基因组DNA被稀释至浓度为50 ng/μL，并在PCR管中添加1 μL稀释样品，以获得2.5 ng/μL（总体积为20 μL）的最终浓度。

PCR反应的具体组分详见补充表4和补充表5。PCR反应后，产物经核酸外切酶I和Lambda核酸外切酶处理，制备用于后续探针检测的单链分析物。所有实验均以三联复制形式进行。

四、结语

综合热力学和动力学原理，我们成功地开创了一种全新的 DNA 杂交探针设计策略，实现了无需繁琐优化即可获得均匀的灵敏性和特异性。

通过深入探索热力学和动力学陷阱，我们克服了传统探针设计中灵敏性和特异性之间的逆相关性。

在这一理论指导下，我们创造性地提出了链置换探针/标准阻断剂组合体系，实现了对不同突变的高效识别。

通过我们的新型4路链交换LED竞争性DNA测试系统（4路SELECT系统），我们在一个统一的条件下成功鉴定出多个突变，而无需耗费大量的时间和资源进行反复优化。

我们的研究为分子数字数据存储、基因分型、DNA 微阵列和突变检测等领域的应用提供了创新性的解决方案。

我们的设计方法不仅极大地简化了实验流程，还显著提高了检测的特异性，为更准确的结果奠定了坚实的基础。

我们相信，基于热力学和动力学的探针设计将为生物医学研究和临床诊断领域带来革命性的突破，为科学进步和人类健康做出更大的贡献。